Dalam teknik PCR dibutuhkan 2 primer oligonukleotida, ukurannya antara 17-30 nukleotida agar nantinya dapat membentuk sekuens DNA target yang akan disalin. Salah satu primer memiliki sekuens yang sama dengan untai DNA Primer sense sementara, primer lain memiliki sekuens yang sama dengan untai DNA lainnya primer antisense. Primer sense akan terikat, melalui interaksi komplementer pasangan basa dengan primer antisense dan akan menginisiasi sintesis untai sense DNA baru. Primer antisense juga akan berikatan dengan untai sense DNA dan akan terbentuk untai antisense DNA PCR melibatkan beberapa tahap atau siklus dimana masing-masing akan menduplikasi target DNA untai ganda. Untai ganda template akan dipisahkan dengan denaturasi termal dan akan didinginkan hingga suhu tertentu agar primer dapat menempel annealing primer pada target DNA. Kemudian, target DNA tersebut akan diperpanjang dengan bantuan DNA Polimerase dan buffer lain yang sesuai. Reaksi PCR dibagi menjadi 3 tahap terpisah dan dalam prosesnya menggunakan suhu yang berbeda-beda. Tahap tersebut yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi, dan akan diulang selama 20-40 siklus untuk mendapatkan hasil amplifikasi sekuens DNA spesifik yang memuaskan. Tahapan pada PCR tersebut terdiri dari proses 30 A. Denaturasi Kedua untai target molekul DNA dipisahkan melalui proses pemanasan. Proses ini bersifat reversibel terhadap proses peningkatan dan penurunan suhu. B. Annealing Kedua untai target kemudian didinginkan untuk nantinya bereaksi dengan primer. Salah satu primer akan membaca dan terikat dengan satu untai DNA target, dan primer mengikat untai lainnya. Kedua primer didesain dengan ujung 3’ bebas agar keduanya dapat saling berhadapan tepat pada regio yang ingin di amplifikasi. Suhu pada proses annealing bergantung pada panjang dan sekuens dari primer serta level spesifisitas yang dibutuhkan pada reaksi PCR. Umumnya suhu yang digunakan yaitu antara 45-60°. C. Ekstensi DNA polimerase akan terikat dengan ujung 3’ bebas dari oligonukleotida dan menggunakan dNTP untuk menyintesis DNA baru 5’-3’. Temperatur optimum untuk replikasi DNA dengan taq DNA polimerase terdapat pada suhu 72° Polimorfisme dapat dideteksi menggunakan real time PCR. Pada awalnya real time PCR dikembangkan sebagai variasi dari PCR konvensional. Perbedaan utama real time PCR dengan PCR konvensional adalah produk dari real time PCR dihitung pada saat reaksi PCR berlangsung atau secara real time bukan setelah reaksinya selesai. Real time PCR menggunakan Flourescent detector dapat mengukur fluoresense dari tiap sampel setiap siklus amplifikasi. Real time PCR menggunakan fluorescence-detecting thermocyclers untuk memanjangkan sekuens asam nukleat spesifik dan menghitung konsentrasinya secara Real time PCR digunakan untuk menghitung jumlah ekspresi genetik dan untuk mengonfirmasi perbedaan ekspresi genetik pada laboratorium riset. Pada laboratorium analitik, real time PCR digunakan untuk mengukur jumlah sekuensi DNA atau RNA tertentu. Kesamaan kedua laboratorium ini adalah real time PCR dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi dan single nucleotide polymorphism. 32 Kelebihan real time PCR adalah kemampuannya untuk mengukur DNA yang teramplifikasi secara simultan sehingga meningkatkan presisi perhitungan kuantitas sekuens target. Selain itu, real time PCR juga tidak terpengaruh terhadap beberapa perubahan apabila terdapat kesalahan dalam proses amplifikasi. Sensitifitas deteksi fluorometrik pada real time PCR dalam mengukur konsentrasi DNA target antara 105 atau 106 konsentrasi Pendeteksi pada real time PCR terdiri dari pewarna yang akan berikatan dengan ikatan rantai ganda DNA atau probe oligonucleotide spesifik yang mengikat target diantara bagian annealing primer. Penggunaan pewarna fluoresensi lebih cocok untuk mendeteksi pada tingkat genus dan tidak cocok untuk penggunaan multipel. Pada probe oligonukleotida spesifik, dapat digunakan secara multipel karena setiap probe memiliki reporter fluoresense spesifik sehingga hasilnya akan lebih spesifik pada kelas spesies atau level Sekuensing DNA Selain melalui real time PCR, polimorfisme atau perubahan susunan basa pada DNA dapat dideteksi melalui beberapa metode, salah satu metodenya adalah sekuensing. Fungsi dari metode ini adalah untuk menentukan urutan nukleotida molekul DNA sehingga dapat digunakan sebagai pendeteksi mutasi suatu gen. Sekuensing DNA pertama kali dilakukan pada tahun 1975 dan teknik ini terus berkembang sampai Teknik sekuensing terbagi menjadi dua yaitu, manual dan automatis. Pada awalnya hanya terdapat dua metode sekuensing manual yaitu metode Sanger dan metode Maxam-Gilbert. Metode Sanger menggunakan dideoksinukleotida spesifik untuk menghentikan sintesis untaian DNA pada nukleotida tertentu saat untaian disintesis. Sedangkan metode Maxam-Gilbert menerapkan metode kimia pada nukleotida spesifik untuk memutus molekul Sekuensing DNA terus berkembang, sehingga saat ini sekuensi juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode Dye-terminator sequencing, Automation and sample preparation, Large scale sequencing strategies, and new sequencing Enzim Restriksi Enzim yang dapat mengenali dan memotong kedua untaian DNA pada urutan pasang basa tertentu merupakan definisi dari enzim restriksi. Enzim ini akan mengenali sekuens spesifik pada DNA yang disebut sebagai restriction site, kemudian akan mengubah konformasi enzim dan DNA. Pengenalan ini dapat dideteksi secara in vitro sehingga, error yang terjadi dapat diukur secara kuantitatif. Metode ini pertama kali ditemukan pada tahun 1960an dan terus berkembang hingga saat ini. 35, 36, 37 Berdasarkan komposisi subunit enzim, kofaktor yang diperlukan, target sekuensi, dan posisi dari restriction site sekuens, enzim restriksi digolongkan menjadi 4 tipe. Tipe I memotong bagian yang jauh dari sekuens pengenalannya dan memerlukan ATP serta S-adenosyl-L-methionine sebagai kofaktornya. Selanjutnya untuk tipe II, Enzim ini akan memotong pada situs pengenalan atau situs DNA yang dekat dan memerlukan magnesium untuk bekerja. Tipe III akan mengenali dua sekuens dengan orientasi berlawanan dan menempel pada urutan sejauh 20-30 susunan basa dari situs pengenalnya serta membutuhkan ATP dan S-adenosyl-L-Methionine untuk restriction digestion dan metilasi. Sedangkan untuk tipe VI enzim restriksi mengenali DNA termodifikasi melalui proses metilasi, hidroksimetilasi, dan Enzim restriksi dapat digunakan untuk berbagai hal. Yaitu, untuk kloning gen dan ekspresi protein, mapping DNA, Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP, mempelajari modifikasi epigenetik, dan menganalisis ekspresi DNA. Pada analisis ekspresi DNA enzim restriksi yang sering digunakan adalah ApeKI untuk proses